Chci začít připomínkou, která se ve veřejných diskusích často ztrácí: Vakcíny s mRNA proti Covidu jsou skutečně novými léčivými přípravky.
Před nouzovým schválením v roce 2020 nebyla technologie mRNA vakcín nikdy ve velkém měřítku nasazena u lidí. Pouze dvě klinické studie, jedna od společnosti Pfizer-BioNTech a jedna od společnosti Moderna, kdy tuto platformu testovaly na lidech. Celkem bylo v historii medicíny mRNA vakcínou očkováno zhruba 37 000 jedinců (nepočítaje dřívější zkušenosti s vakcínami proti vzteklině, CMV a rakovině, které byly omezeny na mnohem menší studie v rané fázi). To není kritika; je to jednoduše konstatování faktu. Znamená to však, že dlouhodobý bezpečnostní profil těchto produktů byl a zůstává neúplně pochopen.
Následující text je známý téměř všem molekulárním biologům. Je to složité, ale vzhledem k rizikům se to snažím zjednodušit. Je důležité jasně vysvětlit molekulární rámec pro každého, protože způsob výroby těchto vakcín přímo určuje, co je uvnitř lahvičky.. A to, co je uvnitř lahvičky, se po injekčním podání rozšíří po celém těle a aktivuje kaskádu událostí, které mohou vést k dlouhodobým zdravotním následkům.
Transkripce in vitro není jen detail výroby
Modifikované mRNA vakcíny se vyrábějí procesem zvaným in vitro transkripce (IVT))IVT je metoda používaná k syntéze modifikované mRNA, která se nakonec stává aktivní složkou vakcíny.
Nejedná se o triviální technickou záležitost. IVT zásadně formuje molekulární složení konečného produktu.
Vědci ze společnosti BioNTech, včetně těch, kteří se přímo podíleli na vývoji vakcíny od společnosti Pfizer, publikovali podrobnou recenzi.1 popisující, jak IVT reakce generují nejen zamýšlenou mRNA v plné délce, ale také řadu vedlejších produktů a nečistot, jak se tyto obvykle odstraňují a jaké mohou být jejich biologické důsledky, pokud přetrvávají. Tyto výrobní postupy spolu s vedlejšími produkty, které vytvářejí, byly také podrobně popsány společností Moderna ve jejích patentech (US10 653 712 B2 a US10 077 439 B2). Ale co je důležitější, tato molekulární biologie byla dobře zavedená dlouho před covidem. Nic z toho není spekulativní.
Výchozí materiál: DNA šablony
V jádru IVT reakce začíná dvouvláknovou DNA, která kóduje požadovaný protein. V tomto případě spike protein SARS-CoV-2.
Sekvence kódující hrot používaná v mRNA vakcínách je geneticky modifikované ke zlepšení stability a buněčné tolerance, včetně dvou aminokyselinových substitucí, které jej odlišují od virové stopy. Tato modifikace je úmyslně.
Samotná DNA šablona může mít různé formy. Během raných klinických studií společnosti Pfizer byly používány fragmenty DNA generované pomocí PCR. Komerční výrobní proces se však spoléhal na DNA odvozenou z plazmidů. To je důležité, protože plazmidy obsahují další regulační sekvence. V případě společnosti Pfizer se jedná o prvky, jako je promotor SV40 a sekvence ori, které vzbuzují obavy, pokud by se dostaly do lidských buněk.
Jakmile je tato DNA šablona přidána do IVT reakce spolu s RNA polymerázou a dalšími složkami, je transkribována do mRNA (obrázek 1).
IVT záměrně produkuje vedlejší produkty
Zatímco požadovaným výstupem IVT je zamýšlený produkt mRNA v plné délce, skutečný výstup je složitější. Patří sem různé vedlejší produkty ve formě (1) různých druhů RNA včetně dvouvláknové RNA (dsRNA), (2) DNA připojené k RNA (hybridy RNA-DNA) a (3) volné DNA z původní templátu (obrázek 2).
Tvorba těchto vedlejších produktů je dobře zdokumentována a nevyhnutelná, a proto je následné čištění naprosto nezbytné pro bezpečnost.
Obrázek 2. Vedlejší produkty a kontaminanty při výrobě IVT. Obrázek upraven z 1.
Čištění má známá omezení
Po výrobě jsou nutné dva kroky čištění, nejprve k odstranění DNA a poté k odstranění vedlejších produktů RNA (obrázek 3):
Obrázek 3. Odstranění vedlejších produktů IVT. Obrázek upraven z 2.
Pro odstranění DNA se do reakční směsi přidá enzym zvaný DNáza I, který se běžně používá k degradaci kontaminující DNA. Zatímco DNáza I je účinná proti volné templátové DNA, četné studie, včetně práce samotných vědců z BioNTech, ukazují, že DNáza I je neúčinná při odstraňování DNA připojené k RNA (hybridy RNA-DNA).
Toto omezení není kontroverzní. Je zdokumentováno v literatuře.
Co ukázaly nezávislé analýzy
Tento kontext je klíčový pro interpretaci nedávných nezávislých analýz hotových lahviček s vakcínou.
Výzkumníci3 a regulační orgány4 uvádějí detekci kontaminantů DNA prakticky v každé testované lahvičce. Mezi tyto kontaminanty patřila jak dvouvláknová DNA, tak hybridy RNA-DNA, které se zdály být rezistentní vůči štěpení DNázou I.
V některých vzorcích byla DNA kódující hroty přítomna v hladinách více než 100krát vyšších než v jiných plazmidových sekvencích.5, což naznačuje nerovnoměrné nebo neúplné štěpení. Sekvenování a kvantitativní PCR analýzy dále detekovaly fragmenty DNA o průměrné délce ~200 párů bází, přičemž některé přesahovaly 4 kilobáze. V několika případech byly pozorovány sekvence pokrývající téměř celý plazmid.
Tato zjištění dohromady vyvolávají vážné otázky ohledně konzistence a úplnosti purifikace během velkovýroby a ohledně potenciálních biologických důsledků zbytkových nukleových kyselin u lidí.
Proč jsou kontaminanty nukleovými kyselinami biologicky důležité
RNA a DNA jsou silnými aktivátory vrozených imunitních drah. Toto není spekulace. Receptory rozpoznávající vzory a dráha cGAS-STING silně reagují na cizí nukleové kyseliny, což spouští zánět, inhibici růstu a dokonce i buněčnou smrt.
Právě tyto mechanismy jsou důvodem, proč produkty genové terapie podléhají přísnému bezpečnostnímu dohledu.
Je ironií, že mRNA vakcíny proti Covidu byly navrženy s modifikacemi konkrétně tak, aby snížily tuto silnou vrozenou imunitní aktivaci. Hybridy RNA-DNA a fragmenty DNA však i přes tyto modifikace stále vyvolávají silné imunitní reakce.
Vytrvalost vyvolává nové otázky
Nyní existují značné důkazy o tom, že spike mRNA a protein přetrvávají v lidských tkáních týdny, měsíce a dokonce i roky po očkování (tabulka 1).
Zatím nevíme, zda tato perzistence odráží prodlouženou stabilitu mRNA, pokračující translaci nebo mechanismy založené na DNA. Vzhledem k pravděpodobnosti integrace DNA a dlouhodobé neintegrované plazmidové DNA ve svalových buňkách však...6 Není nerozumné předpokládat, že perzistence mRNA, proteinů a protilátek proti Spikeovi roky po očkování nesouvisí s nečistotami a vedlejšími produkty DNA po IVT.
Tabulka 1. Perzistence mRNA a proteinu spike po očkování u lidí
Krátkodobé a dlouhodobé bezpečnostní důsledky
Tato data dohromady vyvolávají několik důležitých bezpečnostních aspektů.
Zaprvé, bezprostředně po očkování byly hlášeny akutní imunitní reakce, včetně cytokinových bouří a anafylaxe. Takové silné zánětlivé reakce by neměly být rovnou zavrhovány jako nesouvisející s nečistotami, zejména vzhledem k tomu, co je známo o imunitní aktivaci indukované nukleovými kyselinami.
Za druhé, a to je ještě důležitější, jsou dlouhodobá rizika. Přetrvávající exprese spike genů by mohla pravděpodobně přispívat k chronickým imunitním syndromům. Ještě znepokojivější je možnost integrace DNA, která s sebou nese rizika inzerční mutageneze nebo narušení genů. To znamená riziko rakoviny nebo vývojových vad v závislosti na tom, kde a v jakém věku byla DNA integrována.
Je pozoruhodné, že samotný FDA ve svých informačních listech uvádí, že tyto vakcíny nebyly byly hodnoceny na karcinogenitu (vznik rakoviny) nebo genotoxicitu (poškození DNA), což je rutinní a očekávaný postup v rámci dohledu nad genovou terapií, kde je dlouhodobé sledování standardním.
Regulační mezera ohledně DNA v mRNA vakcínách
Vzhledem k tomu, že již není pochyb o tom, že v mRNA vakcínách existuje zbytková DNA, otázkou je, zda jsou současné směrnice a bezpečnostní limity pro mRNA vakcíny vhodné. Byli jsme ujištěni, že vedlejší produkty DNA jsou v mezích stanovených v regulačních směrnicích. Jaké jsou tedy pokyny FDA ohledně vedlejších produktů DNA a kontaminantů?
Nejčastěji citované pokyny FDA ohledně reziduální DNA (≤10 ng na dávku) byly vyvinuty pro virové vakcíny produkované v živých buňkách, které jsou fragmentované a „nahé“ s omezenou schopností vstoupit do lidských buněk. mRNA vakcíny se však v buňkách neprodukují, jejich reziduální DNA nepochází z hostitelské buňky a co je nejdůležitější, DNA v mRNA vakcínách není nahá. Je spojena se systémy pro dodávání LNP, které konkrétně usnadňují vstup DNA do buněk. Pokyny FDA z roku 2010 jasně uvádějí, že nestanovují relevantní bezpečnostní prahovou hodnotu pro DNA spojenou s produkty na bázi LNP.
Dalším často citovaným doporučením je doporučení WHO pro rekombinantní proteinovou terapii, která se zabývá zbytkovou DNA v produktech, jako jsou monoklonální protilátky nebo hormony produkované v geneticky modifikovaných buňkách. I zde zbytková DNA pochází z hostitelských buněk nebo expresních plazmidů, je přítomna jako stopová, nezapouzdřená DNA (nahá) a konečným produktem je purifikovaný protein, nikoli terapie na bázi nukleové kyseliny (mRNA vakcína). Toto doporučení se tedy nevztahuje na mRNA vakcíny.
Ani regulační standardy FDA, ani WHO, které jsou nejčastěji citovány pro reziduální DNA, nebyly vyvinuté pro mRNA vakcíny a přímo se nezabývají tímto bezpečnostním problémem.
Co WHO řekla o mRNA vakcínách – po jejich nasazení
V roce 2022 vydala Světová zdravotnická organizace pokyny týkající se konkrétně mRNA vakcín7Je pozoruhodné, že tento dokument byl zveřejněn po globální zavedení těchto produktů. Konkrétně se v něm uvádí, že tyto pokyny byly vydány v reakci na: „bezpečnostní, výrobní a regulační otázky spojené s touto novou technologií.„Dokument také obsahuje několik důležitých prohlášení:“
"Vzhledem k tomu, že dosud nejsou k dispozici podrobné informace o metodách používaných k výrobě, kontroly pro bezpečné a účinné mRNA vakcíny dosud nejsou standardizovány a některé podrobnosti zůstávají chráněné a tudíž nejsou veřejně dostupné, není v současné době možné vyvinout specifické mezinárodní směrnice nebo doporučení."
Dále uvádí: „Podrobné výrobní a kontrolní postupy… by měly být projednány s NRA [národním regulačním orgánem] a schváleny jím.] v individuálním případě."
WHO uznává, že kontroly pro mRNA vakcíny dosud nebyly standardizovány a že nebylo proveditelné stanovit specifické mezinárodní směrnice nebo doporučení. Kromě toho je pro hodnocení jednotlivých případů ze strany národních orgánů nutný regulační dohled.
Toto bylo uvedeno po zavedení mRNA vakcín..
A v době psaní této publikace FDA stále nestanovila standardizované pokyny pro mRNA vakcíny a neposkytla žádné důkazy a bezpečnostní údaje, které by podpořily jakékoli limity DNA v mRNA vakcínách.
Konečně je třeba zopakovat: ačkoliv technologie mRNA není nová, před covidem byla regulována jako genová terapie, nikoli jako tradiční vakcína. Bezpečnostní problémy týkající se vedlejších produktů DNA ve vakcínách proti covidu budou stejné jako u jakékoli mRNA vakcíny, včetně vakcín proti chřipce, RSV nebo dokonce mRNA vakcín proti rakovině.
Je to proto, že produkty mRNA jsou zásadně odlišné. Musí vstoupit do buněk a dát jim pokyn k produkci cizího proteinu. To se liší od jiných konvenčních vakcín, které protein dodávají přímo. Pro tuto platformu neexistuje žádný klinický precedens a neexistuje ani klinický precedens pro opakované dávkování. A už vůbec ne v populačním měřítku.
V této fázi, kdy neexistuje pandemie, kdy se hromadí mechanistická data a klinická pozorování a na trhu se objevuje stále více mRNA vakcín, potřebujeme transparentnost a přímé zapojení regulačních orgánů, zejména FDA, do seriózních bezpečnostních studií, které stanoví klíčové směrnice pro výrobu těchto produktů – zejména pokud jde o vedlejší produkty DNA.
Nové technologie vyžadují nové zkoumání – ne mlčení, gaslighting nebo cenzuru.
Reference
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S a kol. Mol Pharm. 4. dubna 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang a kol. (2004) – „Detekce integrace plazmidové DNA do genomové DNA hostitele po intramuskulární injekci a elektroporaci“ (Gene Therapy, 2004). Myším byla intramuskulárně injikována nahá plazmidová DNA a následně provedena elektroporace pro zvýšení absorpce. Autoři identifikovali čtyři nezávislé integrační události 4 týdny po injekci pomocí vysoce citlivé PCR na purifikované genomové DNA (s gelovou separací pro odstranění extrachromozomálních forem). Sekvenování spojů potvrdilo náhodná integrační místa (žádné preferenční hotspoty), což odpovídá nehomolognímu spojení konců. Frekvence integrace byla nízká, ale měřitelná. Toto je jedna z nejjasnějších demonstrací skutečných spontánních integračních událostí in vivo pro nahou plazmidovou DNA ve svalu. Za zmínku stojí, že tato studie použila zesílené dodávání DNA elektroporací, které lze srovnat se zesíleným dodáváním prostřednictvím LNP.
Martin a kol. (1999) – „Plazmidová DNA vakcína proti malárii: Potenciál genomové integrace po intramuskulární injekci“ (Human Gene Therapy). Tato dřívější studie testovala plazmidovou DNA IM u myší a k prozkoumání integrace použila hybridizaci Southern blot a PCR na genomové DNA s vysokou molekulovou hmotností. Zatímco perzistence byla většinou extrachromozomální, studie hlásily důkazy naznačující vzácnou integraci v některých vzorcích (ačkoli ne tak definitivně sekvenované jako pozdější práce). Stanovila měřítko pro nízké riziko, ale uznala potenciál pro velmi nízkofrekvenční události, což ovlivnilo následné pokyny FDA k DNA vakcínám.
Ledwith a kol. (2000) – „Plazmidová DNA vakcíny: Zkoumání integrace do buněčné DNA hostitele po intramuskulární injekci myším“ (Intervirology). Nahá plazmidová DNA injikovaná intramuskulárně myším prokázala a ačkoliv nebyla pozorována žádná detekovatelná integrace, DNA byla stále detekována v čtyřhlavém stehenním svalu až do 26 týdnů. DNA byla extrachromozomální.
7 Expertní výbor WHO pro biologickou standardizaci, 74. zpráva, příloha 3. Hodnocení kvality, bezpečnosti a účinnosti vakcín s mediátorovou RNA pro prevenci infekčních onemocnění: regulační aspekty https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser je významnou profesorkou na katedře vývojové, molekulární a chemické biologie na Lékařské fakultě Univerzity Tufts a ředitelkou konvergenční laboratoře Tufts na Tufts University. Dr. Kuperwasser je mezinárodně uznávaná pro své odborné znalosti v oblasti biologie mléčných žláz, rakoviny prsu a prevence. Je členkou Poradního výboru pro imunizační postupy.
Zobrazit všechny příspěvky
